The significance of membrane segments M6 and M8 in the biogenesis and functioning of the yeast PMA1 H+-ATPase

Issue number 2 from 01.04.2025

Мембранный домен PMA1 H⁺-ATФазы плазматической мембраны дрожжей образуют 10 трансмембранных сегментов (M1–M10), из которых сегменты М6 и М8 являются особенно важными. Для их изучения использовали аланин-сканирующий мутагенез, заменяя каждый из остатков, образующих сегменты, на аланин. Ферменты экспрессировали с плазмидного гена pma1 в секреторных везикулах в условиях теплового шока. В M6 в половине случаев мутантные белки теряли активность (0–7%), но были экспрессированы на уровне 15–87% от дикого типа. В М8 у трети мутантов наблюдался блок в биогенезе (0–7%) или значительное снижение экспрессии (до 16–17%), сопровождавшееся почти полной потерей ферментативной активности (0–10%). Поскольку экспрессирование в секреторных везикулах требует использования повышенной температуры, было проверено действие мутаций, вызывающих нарушение экспрессии и АТФазной активности, на биогенез и функционирование фермента в отсутствие теплового шока, для чего экспрессию осуществляли в плазматических мембранах с хромосомного гена РМА1 при пермиссивной температуре. В случае М6 лишь один мутант из десяти неактивных (F728A) был экспрессирован в плазматической мембране и обладал активностью на уровне дикого типа; остальные мутанты были нежизнеспособными. В случае М8 только мутанты Q798A и I799A не были способны экспрессироваться на уровне плазмалеммы, в то время как I794A, F796A, L797A, L801A экспрессировались на 35–89% и обладали активностью 14–65% от уровня дикого типа. Было сравнено влияние мутаций F728A и F796A на структурно-функциональную организацию РМА1 АТФазы и ее регуляцию при глюкозо-зависимой активации фермента. Обе мутации снижали активность АТФазы на 30–50% и степень ее активации на 30–40%. Данные позволяют сделать вывод о том, что замены в сегменте М6 влияют в первую очередь на функционирование фермента и в меньшей степени на его конформацию и биогенез, предполагая участие исследуемых аминокислотных остатков в транспортном процессе. Остатки в М8, наоборот, играют большую роль в биогенезе АТФазы. В целом, результаты подтверждают важную роль аминокислотных остатков в М6 и М8 для структурно-функциональной организации PМА1 H⁺-АТФазы и указывают на то, что М6 содержит больше остатков, влияющих на функционирование фермента.

49 0

Effect of Mutations in the Extracytosolic Domain of the Saccharomyces cerevisiae H+-ATPase on Its Activity and Regulation

Issue number 3 from 01.05.2023

H⁺-АТФаза плазматической мембраны (PMA1), ключевой фермент метаболизма дрожжей, подвергается множественному фосфорилированию во время биогенеза и функционирования. При этом происходит активация АТФазы – феномен, названный глюкозным эффектом. В работе использовали сайт-направленный мутагенез для определения функциональной роли потенциально фосфорилируемых аминокислотных остатков в экстрацитозольной петле L9-10 (846-SENWTD). Мутантные формы фермента были экспрессированы на уровне плазматической мембраны для определения АТФазной активности и влияния мутаций на биогенез фермента. Иммуноблоттинг показал, что экспрессия мутантных форм АТФазы не была существенно нарушена. Базовая активность (в отсутствие глюкозы) мутантных форм фермента незначительно отличалась от таковой дикого типа; в то же время регуляция ферментов Е847А, Т850А и D851A была нарушена и степень активации глюкозой снижалась в 2‒2.5 раза. Мутант S846A, напротив, обладал повышенной базовой активностью и сохранял способность активироваться. Данные указывают на то, что эти остатки (особенно Ser-846, Thr-850 и Asp-851) важны для нормального функционирования РМА1 и ее регулирования глюкозой.

30 0

Effect of Substituting of Amino Acids Residues Ser-911 and Thr-912 in the Plasma Membrane H+-ATPase of Yeast Saccharomyces cerevisiae on Its Activity and Distribution of Polyphosphates

Issue number 3 from 15.05.2024

Жизненно важный фермент метаболизма дрожжей H⁺-АТФаза плазматической мембраны (PMA1) фосфорилируется в процессе фолдинга и функционирования. Основными сайтами фосфорилирования являются Ser-911 и Thr-912 в С-концевом регуляторном домене. В работе использовали дикую и мутантные формы фермента с заменами этих аминокислотных остатков на Ala или Asp для определения их роли в функционировании АТФазы и распределении полифосфатов (полиР) по фракциям. На целых клетках определяли ростовые параметры, содержание АТФ и распределение полиР in situ. Для определения АТФазной активности in vitro выделяли плазматические мембраны, содержащие фермент дикого типа и мутантные формы. Мутанты S911D, T912D и S911D/T912A обладали АТФазной активностью, близкой к дикому типу; мутант S911A обладал повышенной активностью. Скорость роста штаммов S911D, T912D и S911D/T912A была ниже в 2.0‒3.0 раза, чем у дикого типа, у S911A скорость роста была близкой дикому типу. Мутации S911D и S911D/T912A вызывали снижение содержания АТФ в 2.0‒2.5 раза. Все замены влияли на распределение полиР по фракциям. Влияние зависело от химической природы замены: в случае замены на Asp, меняющей тип фосфосайта, происходило уменьшение фракции полиР1 и увеличение фракции полиР2; при замене на Ala, удаляющей фосфосайт, эффект был противоположный. Содержание фракции полиР3 увеличивалось у всех мутантов. Данные указывают на то, что остатки Ser-911 и Thr-912 важны не только для нормального функционирования РМА1 Н⁺-АТФазы, но и для регулирования фосфорного и энергетического метаболизма.

29 0